Plakkvizsgálat

Foltos plakkok metilénkékkel történő festés után
Plakkvizsgálat a herpes simplex vírus különböző hígítási szintjein

A plakk-vizsgálattal (. Fr. plakk Engl [Plak] a „lemez; folt ;; jel”. Assay , s. Assay ) egy módszer a kimutatására és mennyiségi meghatározására a fertőző citopátiás vírus , amelyben a vizsgálandó minta különböző hígításait sejtkultúrába vezetjük be .

elv

Mivel a sejtkárosító hatás után történik a fertőzés a sejtek vírusokkal (szinonim virionok ) a lízis a sejtek és azok közvetlen szomszédos sejteket. Ezeknek a sejteknek a lizálása után a felszabadult vírusrészecskék eljutnak a szomszédos sejtekbe, és ezáltal a vírus egyre tovább terjed. Ez egy összefolyó sejtpázsit foltjához vezet, amelyben a sejteket lizálták. A lyukak a sejt gyep nevezzük Lysishof vagy plakk . Ha a fertőzött sejtpázsitot ésszerű idő elteltével rögzítik, amelyben az ilyen plakkok létrejöhetnek, majd metilénkékkel ,Festett és mosott kristálylila vagy semleges vörös színnel a plakkok felismerhetők olyan üres, nem festett területekként, amelyekről az elhalt, lizált sejtek a mosás során részben leváltak. A plakkokat megszámoljuk, és az ismert felhasznált térfogattal és a hígítási tényezővel együtt meghatározzuk a fertőző vírusrészecskék koncentrációját a vizsgált mintában, tipikusan fertőző egységenként milliliterenként, NE / ml-ben vagy plakkképző egységenként milliliterenként, PFU / ml-ben. .

Ezzel szemben a koncentrációjának meghatározása a vírusok a vérben vagy szérumban, abban az értelemben egy vírusterhelés révén kimutatására a virális DNS-t vagy RNS-t a PCR-rel , és esetleg egy előző reverz transzkripciós , a plakk assay inaktivált vagy nem fertőző a víruspopuláció részecskéit nem rögzítik. A plakkvizsgálat tehát a fertőző részecskék koncentrációjának közvetlen mérése a mintában. Mivel azonban nem minden, a sejtekre helyezett fertőző virion is vezet fertőzéshez (a vírus hozzáadása után és a polimer hozzáadása előtt), és nem minden vírusrészecske jut el eléggé messze egymástól a sejt gyepén, a plakkvizsgálat hajlamos meghatározni értékeket , amelyek túl alacsony.

A módszer pontosságának javítása érdekében a sejteket fertőzés után polimerrel (például alacsony olvadáspontú agarózzal vagy cellulózporral ) lehet bevonni . A kísérlet három napja alatt sokkok vagy rezgések esetén ez a bevonat megakadályozza a sejtek nem kívánt fertőzését a táptalajon keresztül, és csak a szomszédos sejtek közvetlen fertőzését teszi lehetővé, mivel különben a következő generációk leányvírusainak plakkjai alakulhatnak ki meghatározzuk a közepes és a túl magas koncentrációt. Mivel az alacsony olvadáspontú agarózt 50 ° C körüli hőmérsékletre kell melegíteni, a cellulózporhoz képest nem áll fenn a sejtek melegítésének veszélye.

Vírusok esetében, amelyeknek nincs citopátiás hatása, a víruskoncentrációt a szövetkultúra 50% -os fertőző dózisával (TCID 50 , szinonimája a sejttenyészet fertőző dózisa , CCID 50 ) lehet meghatározni. Ez a módszer azon alapul, fertőzés a sejttenyészet és bármely kimutatási (például indirekt immunperoxidáz assay , immunfluoreszcens vizsgálati , DNS-extrakciót a PCR , RNS extrakció és RT-PCR-rel ), hogy egy sejttenyészet észlelt után hosszabb ideig (például hét nap) egyáltalán fertőzött. A TCID 50 meghatározása elkerüli a leányvírusok általi fertőzés problémáját azáltal, hogy elkerüli a plakkok számlálását, mivel csak azokat a határhígításokat határozzák meg, amelyeknél a fertőzés még mindig végbemegy.

Alkalmazások

A plakkvizsgálat csak olyan vírusok vírusrészecskék koncentrációinak kimutatására használható , amelyek megfertőzhetik az alkalmazott sejtvonalat , szaporodhatnak benne, és a sejtek líziséhez is vezethetnek, pl. B. influenzavírusok az MDCK sejtekben . A esetében litikus vírusok , a plakk assay lehet is használható, hogy meghatározzuk a virális terhelést , a vírustiter vagy a minimális fertőzés dózis.

A fertőző virionok koncentrációjának meghatározása mellett a plakkvizsgálat vírusneutralizációs vizsgálatban (szinonim plakk-redukciós vizsgálat) is használható a virion egyes részeivel szembeni fertőzést gátló antitestek kimutatására . Erre a célra a vírusokat ismert koncentrációban inkubálják a semlegesítő antitestek tesztelésére szolgáló mintával, majd a sejtekre viszik fel őket. Ha az antitestek a vírusok azon felszíni epitópjaihoz kötődnek , amelyek szükségesek a sejtbe történő felvételhez, akkor a plakkvizsgálatban a PFU / ml csökkenése látható az ezen antitestek nélküli negatív kontrollhoz képest .

A plakk-vizsgálattal is használják, hogy vizsgálja a fertőtlenítőszerek az, amelyben a virális genom nem károsodott, és mindaddig kimutatható változatlan, de a fertőzőképessége virionoknak csökken. A plakkvizsgálat arra is felhasználható, hogy megvizsgáljuk, mennyire magas a fertőző vírusok koncentrációja az összegyűjtött mintában, vagy a vírustenyésztés után a sejttenyésztő közegben. Sok vírus (főleg RNS vírus ) esetén a felszabadult virionoknak csak kis százaléka fertőző.

A plakkvizsgálat elődje influenza vírusok esetében rögzítette a fókuszképző egységek számát milliliterenként , a fertőzött embrionált csirke tojások amniójának változása alapján .

irodalom

  • HL Bachrach, JJ Callis és mtsai: Plakkvizsgálat a ragadós száj- és körömfájás vírusára és a vírus reprodukciójának kinetikájára . Virology (1957) 4 (2): 224-36. Oldal PMID 13496542
  • PD Cooper: Állati vírusok plakk-vizsgálata . Adv Virus Res (1961) 8: 319-78. Oldal PMID 13881155

Egyéni bizonyíték

  1. ↑ MB Gonzalez-Hernandez, J. Bragazzi Cunha, CE Wobus: Plaque assay for eger norovirus. In: Vizualizált kísérletek folyóirata: JoVE. 66. szám, 2012, E4297. O., ISSN  1940-087X . doi : 10.3791 / 4297 . PMID 22951568 . PMC 3487293 (szabad teljes szöveg).
  2. ↑ CR Gaush, TF Smith: Az influenza vírus replikációja és plakkvizsgálata a kutya vesesejtjeinek megállapított vonalán. Appl Microbiol. 16 (4): 588-94 (1968). PMID 5647517 .
  3. ↑ M. Matrosovich, T. Matrosovich, W. Garten, HD Klenk: Új alacsony viszkozitású overlay táptalaj vírusos plakk-vizsgálatokhoz. Virol J. 3:63 (2006). PMID 16945126 .
  4. ↑ Y. Gao, I. Nankya, A. Abraha, RM Troyer, KN Nelson, A. Rubio, EJ Arts: A HIV-1 fertőző titrának kiszámítása virtuális TCID50 módszerrel. Methods in Molecular Biology 485. kötet, 27-35. Oldal (2008). PMID 19020816 .
  5. ^ AJ Eisfeld, G. Neumann, Y. Kawaoka: Az influenza A vírus izolálása, tenyésztése és azonosítása. In: Természeti protokollok. 9. évfolyam , 11. szám, 2014. november , 2663–2681 . O. , Doi : 10.1038 / nprot.2014.180 , PMID 25321410 .
  6. ↑ M. de Graaf, S. Herfst, EJ Schrauwen et al.: Javított plakk-redukciós vírus semlegesítési vizsgálat humán metapneumovírusra. J Virol Methods 143 (2): 169-74 (2007). PMID 17420056 .